共聚焦显微镜的分辨率受哪些因素影响

发表时间:2022-08-29      点击次数:87
  共聚焦显微镜,最常见的是共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)或激光共聚焦扫描显微镜(LCSM),是一种光学成像技术,可通过使用空间针孔来阻挡散焦光来提高显微图像的光学分辨率和对比度。在图像形成中。捕获样品中不同深度的多个二维图像可重建三维结构(此过程称为光学切片)。该技术广泛用于科学和工业界,典型的应用是生命科学、半导体检查和材料科学。
 
  共聚焦显微镜是一种扫描成像技术,通过与其他扫描技术(如扫描电子显微镜SEM)进行比较,可以解释所获得的分辨率。CLSM的优点是,例如在AFM或STM中,不需要将探针从表面上悬垂纳米级,例如,通过在表面上用细小进行扫描即可获得图像。从物镜到表面的距离(称为工作距离)通常可与常规光学显微镜相媲美。它随系统光学设计的不同而变化,但是典型的工作距离是几百微米到几毫米。
 
  在共聚焦显微镜CLSM中,样品由点激光源照射,每个体积元素都与离散的散射或荧光强度相关。在此,扫描体积的大小由光学系统的光斑大小(接近衍射极限)决定,因为扫描激光的图像不是无限小的点而是三维衍射图案。此衍射图样的大小及其定义的焦点体积由数值孔径控制系统的物镜和所用激光的波长。这可以看作是使用广角照明的传统光学显微镜的经典分辨率极限。但是,通过共聚焦显微镜,甚至可以改善宽视场照明技术的分辨率极限,因为可以关闭共聚焦孔以消除更高阶的衍射图。例如,如果针孔直径设置为1艾里单位那么只有一阶衍射图样会通过孔径到达检测器,而更高的阶数会被遮挡,从而以稍微降低亮度的代价提高了分辨率。在荧光观察中,共聚焦显微镜的分辨率极限通常受信噪比限制由荧光显微镜中通常可用的少量光子引起的。可以通过使用更灵敏的光电探测器或通过增加照明激光点光源的强度来补偿这种影响。增加照明激光的强度可能会对目标样品造成过度漂白或其他损坏,特别是对于需要比较荧光亮度的实验。当对屈光不同的组织(例如植物叶片的海绵状叶肉或其他包含空气的组织)进行成像时,通常会损害共聚焦图像质量的球面像差。但是,通过将样品安装在光学透明,无毒的全氟化碳(如全氟萘烷)中,可以降低此类像差容易渗入组织,其折射率几乎与水相同。


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