激光显微镜的优势

发表时间:2023-01-04      点击次数:128

     激光显微镜与传统宽场显微镜相比,具有高清晰度、高分辨率、高灵敏度等特点,在生物医学领域应用广泛,成为了该领域重要的成像工具。为什么共聚焦能得到如此多的宠爱,它又有哪些优势呢?本文列举了三方面来论述共聚焦的优势。

  只收集焦平面上的信号,使图像由模糊变清晰

  样品比较厚的时候,普通宽场荧光显微镜只能够观察到整体的样品结构,而共聚焦显微镜却可以展现样品轮廓及内部结构。

  那么共聚焦显微镜是如何实现这一优势的呢?这就要归功于共聚焦的关键硬件—针孔(pinhole),如图二所示,它是检测器前面的一个小孔,放置在与样品焦面共轭的光学平面上。当激发光照射样品时,焦面和非焦平面上的样品区域都会被激发而产生荧光信号,调节合适的针孔大小(通常为1 Au),使焦面上的荧光信号(绿色虚线)可以通过针孔到达检测器,而非焦平面的荧光信号(红色和蓝色虚线)不能通过针孔到达检测器。通过增加硬件针孔,使共聚焦在不改变普通荧光显微镜的制片方法的前提下,得到了清晰的高质量图像。

  可连续获取不同焦平面的信号,实现三维重组

  由于针孔的存在,我们能够只获取到焦平面上的信号,得到高分辨率的二维图像。连续调节Z轴位置,就能够得到不同Z轴位置的二维图像,获得一系列连续的“光学切片"图像。获得这些光学切片后,可使用仪器软件配备的3D模块进行三维图像的重组,构建出清晰的3D图像。这种无损伤的、连续的光学切片图像的采集,实现了“细胞CT"的功能。

  应用于共定位(Co-localization)研究

  共定位结果的精准度与图像的分辨率密切相关,所以我们在进行共定位实验时需要选择更高分辨率的成像方式。共聚焦显微镜相比于传统显微镜以其高分辨率的优势,成为共定位研究的得力工具。

  由于衍射极限的存在,激光显微镜常规共聚焦光学分辨率在200nm左右,当我们需要观察大于200nm的结构时,共聚焦就能够准确判断其共定位程度。如果需要进行共定位分析,可以选用共聚焦软件中配备的共定位分析模块。


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