使用冷冻共聚焦显微镜定位活性循环核孔复合物(上)

更新时间:2023-08-30      点击次数:378


图像:冷冻FIB薄片——SEM和共聚焦荧光图像的叠加。酵母细胞的靶结构(核孔蛋白Nup159-Atg8-split,红色),用箭头标记。比例尺:5µm[1].

本文介绍了如何利用冷冻光学显微镜,尤其是冷冻共焦显微镜来提高冷冻工作流程的可靠性。评估了EM网格和样品的质量,并分析了目标结构的分布。本文展示了如何将冷冻共焦3D数据投射到SEM图像上,将感兴趣结构可靠地保留在FIB切割的薄片内,以便在冷冻TEM中进行进一步研究。




使用冷冻共聚焦显微镜定位核孔复合体

核孔复合体(NPC)是连接真核细胞核外膜和内膜的大的蛋白质组合体。NPC由几百个核孔蛋白(NUP)组合而成,这些核孔蛋白形成一个中心通道,使分子能够选择性地进行核质运输:RNA和核糖体蛋白质从细胞核运输,而在细胞质中翻译的核蛋白质、信号分子、脂质等则穿梭到细胞核中。


为了更好地理解NPC的结构-功能关系以及它们的生物发生和转换的调节,以最高的分辨率在细胞内部环境下研究它们的结构至关重要。图1显示了核膜冷冻电子断层照片的组分分割图[2]。断层照片显示,蛋白酶体与NPC结合,“在细胞核和细胞质之间的通道上建立了蛋白质降解枢纽"(Albert,S.等人,PNAS,2017年12月)。这清楚地显示了冷冻电子断层扫描(cryo ET)提供有关细胞结构和分子社会学的见解的方式。但是,如何用冷冻ET选择性地检查发生频率低的罕见特定细胞事件,例如经历自噬的NPC?

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图1:冷冻电子断层扫描的部分区域,显示出细胞核周围的原生细胞环境。蛋白酶体在两个不同位置与核孔复合物(紫色)相连(橙色:膜栓系蛋白酶体,黄色:篮状栓系蛋白酶体,蓝色:游离蛋白酶体)。图中还显示了核膜(灰色)、核糖体(黑色/白色)和线粒体(红色,带有一排排黄色ATP合成酶)。数据由德国马丁雷德(Martinsried)生化研究所分子结构生物学部门B. Engel博士提供。原出版物:Albert S, Schaffer M, Beck F, Mosalaganti S, Asano S, Thomas HF, Plitzko JM, Beck M, Baumeister W, Engel BD.“蛋白酶体连接到核孔复合体的两个不同位点"[2]




冷冻电子断层扫描

冷冻ET是一种专用的透射电子显微镜技术,该技术采集一系列倾斜图像,并重建观察区域的三维体积(图2)。随着EM硬件和软件的最新进展,可以实现亚纳米级的分辨率。为了使样品尽可能接近原生状态,应将其快速冷冻,以避免破坏性的冰晶形成。产生这种无定形冰的过程称为玻璃化。

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图2:冷冻电子断层扫描技术示意图。使用电子束(TEM)对样本进行观察,同时倾斜样本,从不同观察角度创建一系列图像。3D立体容积得到重建,同时可对蛋白质的分布进行可视化观察与分析。




冷冻FIB研磨

只有厚度低于300nm的标本才能通过冷冻电子断层扫描直接评估。较厚的样品,例如用于NPC分析的酵母细胞核,必须通过铣削过程进行打薄。专用双光束显微镜包括扫描电子显微镜和聚焦镓离子束(冷冻 FIB-SEM),用于烧蚀不需要的材料(图3)。

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图3:聚焦离子束铣削技术示意图。使用扫描电子束观察样本,同时对样本专门使用了聚焦离子束(FIB),以去除薄冰片(薄层)上方及下方的物质。

在铣削过程中,去除感兴趣区域上方和下方的材料,以产生200–300nm厚度的薄片。通过FIB研磨,之前无法检测的厚细胞标本部分现在可以用于冷冻ET。




低温光学显微镜

为了获得特定细胞部位(如正在经历自噬的NPC)的断层照片,必须在FIB研磨和冷冻ET期间确定感兴趣的结构。由于在铣削之前或铣削过程中,大多数结构在SEM中无法清晰识别,因此需要一种在冷冻条件下可视化和定位感兴趣分子的方法。


为了解决该问题,要使用冷冻荧光显微镜,例如使用THUNDER Imager EM cryo CLEM。使用基因编码的荧光标记,可以可视化细胞中的特定靶点,并识别和标记感兴趣的结构。接着,可以在后续的EM步骤中检索图像和xy坐标(图4)。

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图4:靶区划定与检索。冷冻光学显微镜和FIB-SEM中的荧光酵母细胞。左图:酵母荧光图片,其中显示了红色的核仁和绿色的细胞壁。核仁由十字线标记。右图:在FIB-SEM中检索相同的位置,以创建包含感兴趣细胞核的薄片。此处还显示了初始铣削阶段。薄层上下研磨窗口(黑色区域)可见。比例尺:10µm。图片由P.Erdmann博士提供;酵母种株由F.Wilfling创建。马克斯·普朗克生物化学研究所,德国马丁斯里德。

当然,显微镜硬件必须始终保持样品玻璃化。现代宽场显微镜系统使用非常灵敏的摄像头,甚至可以检测微弱表达的蛋白质。此外,通过应用最新的实时去除非焦面信号技术技术,可以解决宽场系统固有的难题,如离焦模糊。


然而,仅检索感兴趣结构的xy坐标是不够的,z坐标也是必要的,以尽可能地使-靶结构包含在产生的FIB薄片中。然而,在宽场显微镜中,沿光轴的分辨率是有限的。


为了提高z分辨率,照理说下一步该选择共聚焦。中间聚焦平面上的针孔会阻挡离焦光线,从而提高对比度和分辨率,尤其是沿z轴的对比度和分辨率(有关共焦原理的更多信息)。



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