图像：冷冻FIB薄片——SEM和共聚焦荧光图像的叠加。酵母细胞的靶结构（核孔蛋白Nup159-Atg8-split，红色），用箭头标记。比例尺：5µm[1].
本文介绍了如何利用冷冻光学显微镜，尤其是冷冻共焦显微镜来提高冷冻工作流程的可靠性。评估了EM网格和样品的质量，并分析了目标结构的分布。本文展示了如何将冷冻共焦3D数据投射到SEM图像上，将感兴趣结构可靠地保留在FIB切割的薄片内，以便在冷冻TEM中进行进一步研究。
使用冷冻共聚焦显微镜定位核孔复合体
核孔复合体（NPC）是连接真核细胞核外膜和内膜的大的蛋白质组合体。NPC由几百个核孔蛋白（NUP）组合而成，这些核孔蛋白形成一个中心通道，使分子能够选择性地进行核质运输：RNA和核糖体蛋白质从细胞核运输，而在细胞质中翻译的核蛋白质、信号分子、脂质等则穿梭到细胞核中。
为了更好地理解NPC的结构-功能关系以及它们的生物发生和转换的调节，以最高的分辨率在细胞内部环境下研究它们的结构至关重要。图1显示了核膜冷冻电子断层照片的组分分割图[2]。断层照片显示，蛋白酶体与NPC结合，“在细胞核和细胞质之间的通道上建立了蛋白质降解枢纽"（Albert，S.等人，PNAS，2017年12月）。这清楚地显示了冷冻电子断层扫描（cryo ET）提供有关细胞结构和分子社会学的见解的方式。但是，如何用冷冻ET选择性地检查发生频率低的罕见特定细胞事件，例如经历自噬的NPC？
图1：冷冻电子断层扫描的部分区域，显示出细胞核周围的原生细胞环境。蛋白酶体在两个不同位置与核孔复合物（紫色）相连（橙色：膜栓系蛋白酶体，黄色：篮状栓系蛋白酶体，蓝色：游离蛋白酶体）。图中还显示了核膜（灰色）、核糖体（黑色/白色）和线粒体（红色，带有一排排黄色ATP合成酶）。数据由德国马丁雷德（Martinsried）生化研究所分子结构生物学部门B. Engel博士提供。原出版物：Albert S, Schaffer M, Beck F, Mosalaganti S, Asano S, Thomas HF, Plitzko JM, Beck M, Baumeister W, Engel BD.“蛋白酶体连接到核孔复合体的两个不同位点"[2]。
冷冻电子断层扫描
冷冻ET是一种专用的透射电子显微镜技术，该技术采集一系列倾斜图像，并重建观察区域的三维体积（图2）。随着EM硬件和软件的最新进展，可以实现亚纳米级的分辨率。为了使样品尽可能接近原生状态，应将其快速冷冻，以避免破坏性的冰晶形成。产生这种无定形冰的过程称为玻璃化。
图2：冷冻电子断层扫描技术示意图。使用电子束（TEM）对样本进行观察，同时倾斜样本，从不同观察角度创建一系列图像。3D立体容积得到重建，同时可对蛋白质的分布进行可视化观察与分析。
冷冻FIB研磨
只有厚度低于300nm的标本才能通过冷冻电子断层扫描直接评估。较厚的样品，例如用于NPC分析的酵母细胞核，必须通过铣削过程进行打薄。专用双光束显微镜包括扫描电子显微镜和聚焦镓离子束（冷冻 FIB-SEM），用于烧蚀不需要的材料（图3）。
图3：聚焦离子束铣削技术示意图。使用扫描电子束观察样本，同时对样本专门使用了聚焦离子束（FIB），以去除薄冰片（薄层）上方及下方的物质。
在铣削过程中，去除感兴趣区域上方和下方的材料，以产生200–300nm厚度的薄片。通过FIB研磨，之前无法检测的厚细胞标本部分现在可以用于冷冻ET。
低温光学显微镜
为了获得特定细胞部位（如正在经历自噬的NPC）的断层照片，必须在FIB研磨和冷冻ET期间确定感兴趣的结构。由于在铣削之前或铣削过程中，大多数结构在SEM中无法清晰识别，因此需要一种在冷冻条件下可视化和定位感兴趣分子的方法。
为了解决该问题，要使用冷冻荧光显微镜，例如使用THUNDER Imager EM cryo CLEM。使用基因编码的荧光标记，可以可视化细胞中的特定靶点，并识别和标记感兴趣的结构。接着，可以在后续的EM步骤中检索图像和xy坐标（图4）。
图4：靶区划定与检索。冷冻光学显微镜和FIB-SEM中的荧光酵母细胞。左图：酵母荧光图片，其中显示了红色的核仁和绿色的细胞壁。核仁由十字线标记。右图：在FIB-SEM中检索相同的位置，以创建包含感兴趣细胞核的薄片。此处还显示了初始铣削阶段。薄层上下研磨窗口（黑色区域）可见。比例尺：10µm。图片由P.Erdmann博士提供；酵母种株由F.Wilfling创建。马克斯·普朗克生物化学研究所，德国马丁斯里德。
当然，显微镜硬件必须始终保持样品玻璃化。现代宽场显微镜系统使用非常灵敏的摄像头，甚至可以检测微弱表达的蛋白质。此外，通过应用最新的实时去除非焦面信号技术技术，可以解决宽场系统固有的难题，如离焦模糊。
然而，仅检索感兴趣结构的xy坐标是不够的，z坐标也是必要的，以尽可能地使-靶结构包含在产生的FIB薄片中。然而，在宽场显微镜中，沿光轴的分辨率是有限的。
为了提高z分辨率，照理说下一步该选择共聚焦。中间聚焦平面上的针孔会阻挡离焦光线，从而提高对比度和分辨率，尤其是沿z轴的对比度和分辨率（有关共焦原理的更多信息）。
