使用冷冻共聚焦显微镜定位活性循环核孔复合物(下)

更新时间:2023-09-18      点击次数:451

使用共聚焦显微镜的三维定位工作流程




在下文中,描述了在3D冷冻共聚焦显微镜中识别荧光目标结构的工作流程,以及如何在冷冻FIB-SEM中检索荧光目标结构,目的是以更可靠的方式将其保留在最终FIB薄片中,以便在冷冻TEM中进行进一步研究。




01

用于检查网格质量和靶分布的成像技术概述

为了评估冷冻EM网格和样本的质量,先创建一张相机概览图像。使用透射或反射显微模式,可以看到载网碳膜是否完整(图1)。

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图1:EM网格——质量评估和靶分布。以A9细胞为例。左图:通过反射成像观察到的网格方格。可见两个玻璃化细胞;在细胞下方可以观察到碳膜上的裂纹。中间图:透射光下相同的网格方格。其它信息,如冰晶污染,变得可见。右图:相同细胞显示Alexa Fluor 488 Phalloidin以绿色标记纤维状肌动蛋白(F-actin),细胞核以红色用DAPI染色。3D成像堆栈的图像投影。比例尺:10 µm.

同时,可以判断有关细胞及其相对于网格方格的位置的信息。在随后的EM步骤中,只能评估网格方格中心附近的目的细胞。为了改善细胞的定位,可以在将细胞接种到载网碳膜上之前应用微排布技术[3]。  


在下文中,基于未发表的图像(德国海德堡EMBL的Herman Fung和Julia Mahamid提供)和《核孔的在细胞内的原位结构及其转换的快照》中的数据[1],详细解释了3D冷冻靶向过程


有关载网碳膜完整性的信息,以及荧光样品在网格方格内合适的位置,有助于选择合适的FIB研磨位置(图2)。

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图2:透射光模式和荧光模式的概览图像。具有表达核孔蛋白Nup159-Atg8-split Venus(红色)和校准珠子(红色,强信号,圆形,1µm)的酵母细胞。结合载网碳膜质量信息,可以确定FIB铣削的合适位置。绿色框表示以下步骤中使用的区域。载网旋转调整为FIB视图(见下文);比例尺:20 µm.




02

通过高分辨率共焦z堆叠获得3D信息

在为FIB铣削选择相关位置后,在这些位置沿光轴创建一系列荧光图像以获得3D信息。与普通宽场系统相比,要是想提高z方向的分辨率,共聚焦显微镜是方法。通过激光逐点扫描样品,只记录荧光发射的聚焦信息。然后,将在不同z位置记录的2D图像组合成3D堆栈(图3)。

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图3:共焦z堆栈的三维显示。记录了与图2所示相同的网格方格。校准珠子在绿色和红色区域中显示出强烈的荧光,但仍然可以通过信号的强度和形状进行区分。核孔蛋白Nup159-Atg8-split Venus仅以红色显示。后续FIB铣削的靶位置之一由放大框中的箭头指示。

显微镜系统的轴向分辨率主要取决于所用物镜的开启角度(所谓的数值孔径)。由于商品化冷冻显微镜为方便使用者而使用空气物镜(不需要浸入,可能会影响样品的玻璃化状态),因此实际分辨率有限。xy的典型分辨率为200 nm,z的分辨率约为800 nm。


为了能够正确定位感兴趣的细胞位置,可以将校准珠子作为参考结构应用于样品,以便在3D中对齐和关联荧光和EM图像[4]


典型的珠子尺寸为1µm,呈球形,这使其中心坐标能够进行亚衍射拟合。通过SEM中的背散射电子,可以更清晰地观察到含有金属的微珠,从而将它们与大小相似的冰晶区分开来。优先选择荧光发射光不同于实际目标结构的荧光发射光的珠子,以便能够更好地区分(图4)。

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图4:坐标变换原理。使用基准点作为支撑点,将靶坐标从光学显微镜转移到FIB-SEM。黄色:校准珠子;红色:Nup159-Atg8-split Venus.左图:共聚焦图像的投影,圆圈标记示例性珠子和箭头标记目标NUP。中心图像:用相同珠子标记的SEM图像。右图:通过在两种模式中叠加珠子信息创建叠加荧光信号和SEM信号的图像。因此,目标位置被投射到SEM图像中。比例尺:20 µm.




03

标记基准珠和靶

由于基准点在LM和SEM中都可见,因此它们的坐标可用于在两种模式之间转换旋转、平移和缩放等参数。然后,可以将共聚焦显微镜中标记的靶坐标转换为FIB铣削过程,以增加获得FIB薄片中具有感兴趣结构的概率


然而,用于精确3D定位的商业软件解决方案尚未开发,但基于上述出版物(3D Correlation Toolbox),有一个开源解决方案可用。


使用3D Correlation Toolbox,可以加载共聚焦图像数据,标记靶和校准珠子,并自动确定其中心坐标。然后将定义的坐标标记投射到FIB图像上,以定义铣削的xyz坐标(图5)。




04

FIB研磨

为了将靶区域研磨成适当薄的体积,感兴趣结构的上方和下方各设定一个铣削窗口,如荧光信号投射到FIB图像上所示(图5)。然后施加镓离子束,并削除相应窗口中的材料。可以在一个EM网格上创建多个薄片,从而提高工作流的效率。

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图5:荧光在FIB图像上的投影,用于精密铣削。左图:铣削前样品的FIB视图与共聚焦投影的叠加。箭头表示靶NUP结构。黄色:校准珠子;红色:Nup159.Atg8-split-Venus.中心图像:在关联共焦和FIB图像之间的珠子位置后,在FIB视图上叠加共焦图像平面。箭头表示下薄片上的靶结构。右图:研磨后共聚焦图像投影和SEM视图的叠加。产生的薄片中含有目标结构荧光(见箭头)。




05

冷冻电子断层扫描

为了以分子分辨率获得样品的结构信息,使用冷冻透射电子显微镜对冷冻样品薄片进行成像。通过在薄片的SEM和TEM视图之间进行配准,可以根据薄片中包含的目标荧光信号确定倾斜序列采集区域。然后将成像的倾斜序列进行计算组合,以重建细胞内部的三维体积。通过对许多同类单个蛋白的结构信息进行平均(亚层析平均),可以获得更好的大分子解析结构。在图6中,图5所示的下薄片由冷冻ET成像。断层照片的分割结果显示了核膜与靶NUP位置。

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结 语

本文表明,冷冻共聚焦显微镜是冷冻工作流程中的一个重要组成部分,用于评估EM载网上玻璃化样品的质量和目标结构分布。在冷冻条件下记录的高分辨率共聚焦数据使科学家能够在3D荧光下定位感兴趣结构。3D体积图像可作为光电关联的参考,以检索FIB-SEM中的目标结构进行铣削,随后在冷冻TEM中进行电子断层扫描,以获得目标结构在其原生细胞环境中的高分辨率图像。





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