使用共聚焦显微镜的三维定位工作流程
在下文中，描述了在3D冷冻共聚焦显微镜中识别荧光目标结构的工作流程，以及如何在冷冻FIB-SEM中检索荧光目标结构，目的是以更可靠的方式将其保留在最终FIB薄片中，以便在冷冻TEM中进行进一步研究。
为了评估冷冻EM网格和样本的质量，先创建一张相机概览图像。使用透射或反射显微模式，可以看到载网碳膜是否完整（图1）。
图1：EM网格——质量评估和靶分布。以A9细胞为例。左图：通过反射成像观察到的网格方格。可见两个玻璃化细胞；在细胞下方可以观察到碳膜上的裂纹。中间图：透射光下相同的网格方格。其它信息，如冰晶污染，变得可见。右图：相同细胞显示Alexa Fluor 488 Phalloidin以绿色标记纤维状肌动蛋白（F-actin），细胞核以红色用DAPI染色。3D成像堆栈的图像投影。比例尺：10 µm.
同时，可以判断有关细胞及其相对于网格方格的位置的信息。在随后的EM步骤中，只能评估网格方格中心附近的目的细胞。为了改善细胞的定位，可以在将细胞接种到载网碳膜上之前应用微排布技术[3]。
在下文中，基于未发表的图像（德国海德堡EMBL的Herman Fung和Julia Mahamid提供）和《核孔的在细胞内的原位结构及其转换的快照》中的数据[1]，详细解释了3D冷冻靶向过程。
有关载网碳膜完整性的信息，以及荧光样品在网格方格内合适的位置，有助于选择合适的FIB研磨位置（图2）。
图2：透射光模式和荧光模式的概览图像。具有表达核孔蛋白Nup159-Atg8-split Venus（红色）和校准珠子（红色，强信号，圆形，1µm）的酵母细胞。结合载网碳膜质量信息，可以确定FIB铣削的合适位置。绿色框表示以下步骤中使用的区域。载网旋转调整为FIB视图（见下文）；比例尺：20 µm.
在为FIB铣削选择相关位置后，在这些位置沿光轴创建一系列荧光图像以获得3D信息。与普通宽场系统相比，要是想提高z方向的分辨率，共聚焦显微镜是方法。通过激光逐点扫描样品，只记录荧光发射的聚焦信息。然后，将在不同z位置记录的2D图像组合成3D堆栈（图3）。
图3：共焦z堆栈的三维显示。记录了与图2所示相同的网格方格。校准珠子在绿色和红色区域中显示出强烈的荧光，但仍然可以通过信号的强度和形状进行区分。核孔蛋白Nup159-Atg8-split Venus仅以红色显示。后续FIB铣削的靶位置之一由放大框中的箭头指示。
显微镜系统的轴向分辨率主要取决于所用物镜的开启角度（所谓的数值孔径）。由于商品化冷冻显微镜为方便使用者而使用空气物镜（不需要浸入，可能会影响样品的玻璃化状态），因此实际分辨率有限。xy的典型分辨率为200 nm，z的分辨率约为800 nm。
为了能够正确定位感兴趣的细胞位置，可以将校准珠子作为参考结构应用于样品，以便在3D中对齐和关联荧光和EM图像[4]。
典型的珠子尺寸为1µm，呈球形，这使其中心坐标能够进行亚衍射拟合。通过SEM中的背散射电子，可以更清晰地观察到含有金属的微珠，从而将它们与大小相似的冰晶区分开来。优先选择荧光发射光不同于实际目标结构的荧光发射光的珠子，以便能够更好地区分（图4）。
图4：坐标变换原理。使用基准点作为支撑点，将靶坐标从光学显微镜转移到FIB-SEM。黄色：校准珠子；红色：Nup159-Atg8-split Venus.左图：共聚焦图像的投影，圆圈标记示例性珠子和箭头标记目标NUP。中心图像：用相同珠子标记的SEM图像。右图：通过在两种模式中叠加珠子信息创建叠加荧光信号和SEM信号的图像。因此，目标位置被投射到SEM图像中。比例尺：20 µm.
由于基准点在LM和SEM中都可见，因此它们的坐标可用于在两种模式之间转换旋转、平移和缩放等参数。然后，可以将共聚焦显微镜中标记的靶坐标转换为FIB铣削过程，以增加获得FIB薄片中具有感兴趣结构的概率。
然而，用于精确3D定位的商业软件解决方案尚未开发，但基于上述出版物（3D Correlation Toolbox），有一个开源解决方案可用。
使用3D Correlation Toolbox，可以加载共聚焦图像数据，标记靶和校准珠子，并自动确定其中心坐标。然后将定义的坐标标记投射到FIB图像上，以定义铣削的xyz坐标（图5）。
为了将靶区域研磨成适当薄的体积，感兴趣结构的上方和下方各设定一个铣削窗口，如荧光信号投射到FIB图像上所示（图5）。然后施加镓离子束，并削除相应窗口中的材料。可以在一个EM网格上创建多个薄片，从而提高工作流的效率。
图5：荧光在FIB图像上的投影，用于精密铣削。左图：铣削前样品的FIB视图与共聚焦投影的叠加。箭头表示靶NUP结构。黄色：校准珠子；红色：Nup159.Atg8-split-Venus.中心图像：在关联共焦和FIB图像之间的珠子位置后，在FIB视图上叠加共焦图像平面。箭头表示下薄片上的靶结构。右图：研磨后共聚焦图像投影和SEM视图的叠加。产生的薄片中含有目标结构荧光（见箭头）。
为了以分子分辨率获得样品的结构信息，使用冷冻透射电子显微镜对冷冻样品薄片进行成像。通过在薄片的SEM和TEM视图之间进行配准，可以根据薄片中包含的目标荧光信号确定倾斜序列采集区域。然后将成像的倾斜序列进行计算组合，以重建细胞内部的三维体积。通过对许多同类单个蛋白的结构信息进行平均（亚层析平均），可以获得更好的大分子解析结构。在图6中，图5所示的下薄片由冷冻ET成像。断层照片的分割结果显示了核膜与靶NUP位置。
结 语
本文表明，冷冻共聚焦显微镜是冷冻工作流程中的一个重要组成部分，用于评估EM载网上玻璃化样品的质量和目标结构分布。在冷冻条件下记录的高分辨率共聚焦数据使科学家能够在3D荧光下定位感兴趣结构。3D体积图像可作为光电关联的参考，以检索FIB-SEM中的目标结构进行铣削，随后在冷冻TEM中进行电子断层扫描，以获得目标结构在其原生细胞环境中的高分辨率图像。
